汉防己甲素抗肝纤维化研究进展

汉防己甲素(又称粉防己碱;tetrandrine; tet)是从防己科千金藤属植物粉防己(stephania tetrandra s. moore)的块根中分离出的主要生物碱，其分子式为c33h42n2o6 ，化学结构属于双苄基异喹啉类. 现代药理研究证实，tet是一种钙离子拮抗剂，主要作用于钙离子通道，影响钙离子的跨膜转运以及在细胞内的分布利用. 近年来,tet对肝纤维化的防治作用已渐渐为人们所重视. 随着肝脏细胞分离培养技术的建立及分子生物学技术的进步，tet抗肝纤维化的研究已深入到细胞、亚细胞及分子水平. 本文就近年来的有关研究作一综述.

1　tet对大鼠实验性肝纤维化的影响

用四氯化碳(ccl4)诱导大鼠肝纤维化模型，研究tet对实验性肝纤维化的防治作用. 结果显示各期治疗组大鼠肝组织及血清透明质酸(hyaluronic acid, ha)含量、血清谷丙转氨酶活性(alt)均低于模型对照组(p＜0.01). 3wk时治疗组大鼠肝脏细胞变性、坏死及炎细胞浸润程度均显著低于模型对照组. 12wk时模型对照组成纤维细胞增生达2.8级，he及vg染色均示假小叶形成；而治疗组虽有成纤维细胞及胶原增生，但肝小叶形态完整. 表明tet能显著改善肝功能，减轻肝脏病理损害程度，抑制肝脏细胞外基质形成［1］. tet能抑制肝纤维化大鼠肝组织中储脂细胞(ito细胞)的增殖转化，使ⅳ型胶原沉积减少，结蛋白阳性细胞数显著少于生理盐水对照组(p＜0.01). tet治疗组的ito细胞数量及ito细胞和粗面内质网平均面积也较生理盐水对照组减少(p＜0.05)［2,3］. 在肝硬变门脉高压大鼠中，tet可使肝细胞损害减轻，肝内纤维组织减少，alt、碱性磷酸酶(alp)和血清总胆红素(stb)降至正常［4］. tet也可降低门脉高压大鼠的门静脉压力和平均动脉压［5］. tet对血清ⅲ型前胶原肽(procollagen ⅲ peptide, pⅲp)、ha和肝内炎症等均有明显抑制作用，与传统抗纤维化药物秋水仙碱的效果接近；对ito细胞的增殖转化及胶原沉积的抑制则优于秋水仙碱，且该药无明显毒副作用［6］.

2　tet抗肝纤维化的细胞学研究

肝纤维化系由肝结缔组织弥漫增生所致，是多种慢性肝病发展成肝硬变的渐进过程. 参与肝纤维化形成的细胞主要有成纤维细胞、ito细胞、免疫活性细胞、肝细胞、内皮细胞及库普弗细胞等. 这些细胞分泌产生胶原等过多的细胞外基质，与细胞成分共同在肝脏内沉积，导致肝纤维化.

2.1　tet对成纤维细胞生长增殖的影响　成纤维细胞能大量合成和分泌胶原蛋白、纤维连接蛋白(fibronectin, fn)、ha及层连蛋白(laminin, ln)等结缔组织接地基质成分. 因此，它的生长增殖对肝纤维化的形成具有不可忽视的作用. 采用流式细胞术观察不同浓度的tet(10，20，30，40，50，60μg/ml)对3t6成纤维细胞生长增殖的影响，结果表明tet能显著延缓细胞g1-s期的进程，抑制s期dna的含量而增加g1和g2期蛋白质的含量，使细胞呈现不平衡生长直至死亡. 此作用具有一定的量效关系. 加入外源性的ca2+及atp证明，tet对成纤维细胞生长增殖的作用与阻断ca2+内流无关［7，8］. 也有研究报道，tet(1.0μg/ml)阻止细胞由g1期进入s期，tet(1.5，2.0μg/ml)则能显著增加3t6细胞g2+m期细胞，降低细胞rna含量，增加细胞蛋白质含量，但dna含量不变，使细胞不平衡生长，从而对其增殖产生剂量依赖性的抑制作用［9］. 以3h-脯氨酸掺入量及掺入抑制率为指标，观察tet对3t6成纤维细胞增殖及胶原合成的影响，结果表明，10μg/ml～50μg/ml浓度范围内，tet能显著抑制3t6成纤维细胞的胶原合成，此抑制作用与浓度成正相关. 倒置显微镜下观察发现细胞生长良好，无明显形态改变，表明tet对细胞增殖及胶原合成的抑制作用非直接杀伤作用，而是在分子水平上起作用［10］. tet也可浓度依赖性地抑制人胚肺成纤维细胞的增殖及胶原合成，抑制率随时间延长而升高.

2.2　tet对肝细胞生长增殖的影响　肝细胞为肝脏的实质细胞，占肝脏90%以上，既能合成ⅰ，ⅳ型胶原，又能合成硫酸软骨素及ha等基质. 在生理条件下，其胶原合成很少，但在某些病理条件下其合成胶原的能力明显增强. 在体外培养的肝细胞中直接加入ccl4造成损伤模型，观察细胞膜流动性及细胞内ca2+浓度. 结果表明tet可明显抑制ccl4引起的肝细胞存活率降低和乳酸脱氢酶的释放，稳定ca2+浓度，保持细胞膜流动性，具有保护肝细胞的作用［11］. 采用流式细胞技术检测不同浓度的tet对大鼠rbl肝细胞生长增殖的影响. 结果显示随着tet浓度的增加(10，20，30，40，50，60μg/ml)，g1-s期的进程加速，且s期dna含量及g1和g2期蛋白质含量均增加，呈正量效关系. 经加入外源性ca2+及atp证明tet促进肝细胞生长增殖的作用与阻断ca2+内流无关. 结果提示具有钙通道阻断作用的tet可促进肝细胞生长增殖［12］. 但也有研究得出不同结论［10,13］. 以3h-胸腺嘧啶(3h-tdr)、3h-脯氨酸掺入量及掺入抑制率为指标，研究tet对人胎肝细胞及大鼠肝细胞dna及胶原合成的影响. 结果显示10μg/ml～50μg/ml浓度范围内，tet能明显抑制两种细胞dna及胶原合成，抑制程度与浓度呈正相关.

2.3　tet对ito细胞生长增殖的影响　ito细胞位于肝窦周围间隙内，其功能是储存脂肪和维生素a. 此外还可产生结缔组织和基质. 现在认为ito细胞是肝小叶内一种相对不活动的成纤维细胞，在一定的条件下可转化为成纤维细胞，在肝硬变的发生发展中具有重要作用. 它是正常及肝纤维化时产生胶原的主要细胞. 在ccl4诱导的大鼠肝纤维化模型中，tet能明显抑制肝组织中ito细胞的增殖及转化［2，6］. 体外培养的ito细胞中加入tet后，其dna及胶原合成显著受抑，抑制程度与tet浓度及作用时间成正相关. tet还可阻断血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor; pdgf)的促ito细胞增殖及胶原合成作用. 结果提示tet除直接作用外，还通过抑制pdgf的作用而起到间接的抗肝纤维化作用［14］.

3　tet抗肝纤维化的亚细胞学研究

肝实质细胞富含线粒体(mitochondria, mc)、微粒体(microsome, ms)、溶酶体(lysosome, ls)等细胞器. 研究表明，mc和ms的作用不再限于能量代谢与蛋白质合成，它们还参与调节胞质游离ca2+的浓度，其对ca2+“封闭”作用的丧失是导致细胞损伤、死亡的重要原因，而持续的肝损伤往往会导致肝纤维化. mc中的单胺氧化酶(monoamine oxidase; mao)是参与胶原合成代谢的酶，血清中mao活性升高是反映肝纤维化形成的灵敏指标. n-乙酰-β-氨基葡糖苷酶(n-acetyl-β-d-glucosaminidase, nag)则广泛分布于mc，因参与基质蛋白多糖分解而与肝纤维化有关. 血清中nag活力升高，表明基质的合成分解均很活跃. 在ccl4-诱导大鼠模型中的实验说明小剂量tet能明显降低mc的mac和nag活性；增加mc对ca2+的主动摄取，减少其被动释放；增加mc内膜表层和脂双层中心处的流动性及巯基含量(sh)［10，11］. 结果提示小剂量tet具有良好的mc保护和抗纤维化作用. tet也可增加ms中的sh含量，降低ms的nag活性，增加ms的标志酶-葡萄糖-6、磷酸酶-的活性，对ms具有良好的保护作用.

4　tet抗肝纤维化的分子生物学研究

体外培养的3t6细胞中，以cdna为探针进行核酸分子杂交［15］. 结果显示tet能显著降低3t6细胞ⅰ，ⅲ，ⅳ型前胶原mrna水平(p＜0.05～0.01). 在ccl4大鼠肝纤维化模型中，tet早期治疗组显著降低了ⅰ,ⅲ,ⅳ型前胶原mrna水平(p＜0.05～0.01)，提示tet对ⅰ，ⅲ，ⅳ型胶原基因的表达具有抑制作用是在转录水平上［16］. tet亦可降低肝纤维化时pdgf,pdgf受体β(platelet-derived growth factor receptor, pdgfrβ)及转化生长因子β1(tansforming growth factor, tgfβ1)的mrna表达水平，提示tet可能通过抑制tgfβ1，pdgf等肝纤维化相关生长因子的表达而间接抑制胶原合成［17，18］.

5　tet治疗肝硬变和慢性肝病临床观察

33例肝硬变患者口服tet 3mo后，其静脉色氨酸耐量试验明显改善；服药18mo后，血清ⅲ型前胶原肽(procollagen ⅲ peptide, pⅲp)含量显著下降(p＜0.01)［19］. 54例肝硬变患者口服tet治疗后，随访18mo，结果血清ha，pⅲp、肝组织ⅰ，ⅲ型胶原与治疗前相比有显著差异(p＜0.05～0.01). 与用肝泰乐治疗的对照组比较也有统计学意义(p＜0.01). tet治疗组患者肝肾功能也有不同程度改善［20］. 115例慢性肝病患者口服tet治疗后随访6mo，结果发现：血清ha，pⅲp含量较治疗前显著降低(p＜0.01)；14例(15.4%)肝纤维化消失，54例(58.1%)胶原纤维沉积明显减轻，19例(20.4%)胶原纤维轻度减轻；炎细胞浸润明显减轻或消失，ito细胞数量减少，与肝泰乐对照组相比有显著差异(p＜0.001)［14］. 结果表明tet对临床上肝纤维化的治疗有确实的疗效.

总之，tet对肝纤维化的防治作用已为实验和临床等各方面所证实. 随着对tet药代动力学、药物配伍、最佳药物剂型及其用药疗程等各方面的深入研究，tet可望作为一种被广泛应用于临床的抗肝纤维化药物.

2005年09月15日
信息来源：世界华人消化杂志 1999年第2期第0卷